一、质粒连接体系的计算公式

【公式一】

pmol数*kb数（双链）*0.65=μg数

案例：

片段大小=555bp=0.555kb，浓度=0.19μg/ul

载体大小=4.969kb，浓度=0.115μg/μl

选取载体0.04pmol；片段0.12pmol（载体:片段=1:3）

代入公式①得出，20μl体系，载体用0.129μg（1.12μl），片段用0.043ug（0.23μl）

载体和片段的总质量=0.129+0.043=0.172μg（符合20μl体系所要求的0.02~0.2μg范围)

【公式二】

设x1为DNA的片段pmol数，x2为其μg数；

设y1为载体pmol数，y2为载体μg数；

a为DNA的片段的kb数，b为载体的kb数（并且假定摩尔比为DNA的片段:载体=3:1）

则有：

x1*a*0.65=x2

y1*b*0.65=y2

x1:y1 =3

x2+y2=0.2（总质量）

计算得出：

y2=0.2/（3a/b+1）

x2=0.2-y2

二、连接体系调配的相关要求

1. 先测量目的片段和载体的OD260。（不用担心浪费片段和载体，实际用量是很少的）

2. 调整载体与片段的摩尔比。

(1) 载体与片段的比例应该在1:2~6之间（片段多一些）

(2) 连接体系如果是20μl，那么载体和片段的总质量（μg）要在0.02~0.2μg之间；如果是10μl，则在0.01~0.1μg之间（一般用量最好接近上限）

3. EDTA不能加太多，否则可能会影响连接酶。

三、连接体系加样组分和步骤（体积按需调整，以下以20μl体系为例）

1）将以下3种液体混匀，45°C水浴5min，迅速插入冰中，冰浴2min。

2）保持冰浴，加入缓冲液和酶。

文章出自：验外实包   想了解更多请关注：http://www.dj-cro.com/